Участь пептидів у регуляції активності хроматину та освіті вільних радикалів. Оскільки мітохондріальна ДНК кодує в основному поліпептиди дихального ланцюга і не містить інформації про відомих репараційних білках, протягом довгого часу вважали, що репарація пошкоджень в мітохондріальної ДНК неможлива. Єдиною альтернативою традиційного лікування мітохондріальних цітопатій була потенційна можливість генетичної модифікації втрачених мітохондріальних функцій. Однак більш глибокі дослідження, проведені Bohr et al. в лабораторії молекулярної геронтології і генетики Національного інституту старіння (Балтімор, США) показали, що в мітохондріальних екстрактах можуть бути виявлені багато з відомих ферментів репарації ядерної ДНК (ДНК-фосфорілаза, етілгуанін-трансфераза, метилтрансфераза, урацил-ДНК-глікозілаза, 8-оксогуанозін -ендонуклеаза класу I, ендонуклеаза класу II, dRP-міазная активність).
Для встановлення механізму репарації мітохондріальної ДНК плазміду, що містить відомі дефекти підстав, обробляли мітохондріальними екстрактами, виділеними як з тканин щурів, так і з тканин людини. Було показано, що репарація можлива, але процес носить комплексний характер і вимагає участі кількох репараційних ферментів, експрессіруемих ядерної ДНК. Так, для видалення 8-oxo-dG шляхом заміни підстави потрібна участь ферменту оксігуанозін-ДНК-глікозілази. Клітини з віддаленим геном цього ферменту не можуть брати участь у репарації мітохондріальної ДНК і до закінчення життєвого циклу містять в 20 разів більшу кількість 8-oxo-dG, ніж мітохондріальна ДНК клітин дикого типу. Вищезазначені факти свідчать про те, що модуляція експресії репараційних ферментів ядерної ДНК під дією яких-небудь зовнішніх сигналів може впливати на відновлення пошкодженого мітохондріального геному і потім - на утворення вільних радикалів у клітині. У наших попередніх дослідженнях було показано, що короткі пептиди тимуса і епіфіза можуть брати участь у регуляції генетичної активності клітин. Це стало передумовою для вивчення впливу мелатоніну, Епіталамін і синтетичних пептидів Вілона і епіталона на вільнорадикальні процеси у людини і тварин.
Як було показано раніше, рівень освіти вільних радикалів і їх знешкодження неоднаковий для різних органів. Найбільш інтенсивне утворення активних форм кисню спостерігається в сироватці крові, де воно більш ніж в 2 рази перевищує відповідні показники в печінці та мозку. При цьому рівень загальної антиоксидантної активності в сироватці крові значно нижче в порівнянні з таким в печінці та мозку. Введення Вілона не зробило скільки-небудь істотного впливу ні на один з вивчених показників. Введення епіталона ефективно гнітило утворення активних форм кисню в тканини мозку. Закономірно з цим у присутності епіталона послаблявся процес перекисного окислення ліпідів. Причому в головному мозку дію епіталона було направлено переважно на кінцеві етапи цього процесу (підстави Шиффа), а в печінці - в основному на початкові етапи (дієнові кон'югати). Введення мелатоніну призводило до достовірного підвищення загальної антиоксидантної активності в сироватці крові мишей і гнітило обидва етапи перекисного окислення ліпідів у печінці та головному мозку.
Як було зазначено раніше, найбільш інтенсивне утворення активних форм кисню, в тому числі при старінні організму, спостерігається в сироватці крові. Були проведені додаткові дослідження впливу мелатоніну і комплексу пептидів епіфіза (епітала-хв) на показники вільнорадикальних процесів в сироватці крові щурів. Епіталамін вводили 2-3-місячним щурам протягом 5 днів в ранкові години підшкірно в дозі 0,5 мг на тварину. Мелато-нин давали з питною водою (20 мг/л). При введенні Епіталамін істотно знижується інтенсивність перекисной хемілюмінесценції в сироватці крові (в 3,4 рази) і перекисного окислення ліпідів. Це виражається в значному зниженні вмісту дієнових кон'югатів (в 4,1 рази), тоді як вміст підстав Шиффа мало лише тенденцію до зниження. Рівень пероксидації білків сироватки крові не зазнавав помітних змін при впливі Епіталамін. Мелатонін також знижував інтенсивність перекисного окислення ліпідів - в сироватці крові знижувався рівень дієнових кон'югатів і підстав Шиффа.
Слід зазначити, що при введенні мелатоніну зміст карбонільних похідних амінокислот в білках кілька збільшувалася. Введення як Епіталамін, так і мелатоніну супроводжується істотним збільшенням загальної антиоксидантної активності (на 35%). Наші спостереження свідчать про те, що епіталамін і мелатонін сприяють зниженню вироблення вільних радикалів в клітині, захищають білки і ліпіди від перекисного окислення і, таким чином, сприяють підтримці структурно-функціональної цілісності клітини і її резистентності до зовнішніх несприятливих впливів. Слід підкреслити, що досліджені нами гормональні продукти епіфіза (епіталамін, мелатонін), а також синтетичні пептиди (ВІЛОНА і епіталон) мають вираженої загальної антіокислітельной активністю, однак механізм їх дії, ймовірно, неоднаковий і має комплексний характер. Мелатонін і пептиди епіфіза можуть впливати як на функціонування ферментів антиоксидантної системи клітини, так і на вироблення в ній вільних радикалів. У подальших експериментах з плодовими мушками Drosophila melanogaster ми досліджували можливу участь пептидів в регуляції вироблення вільних радикалів в мітохондріях протягом життя організму.
Введення в живильне середовище епіталона підвищує активність ферментів антиоксидантного захисту у Drosophila melanogaster і послаблює інтенсивність перекисного окислення ліпідів протягом усього життя імаго. Нами проведено дослідження впливу пептидів епіталона і Вілона на генерацію активних форм кисню в субклітинних фракціях D melanogaster лінії НА +. Для цього епіталон і Вілопо, розчинені у фізіологічному розчині, додавали в живильне середовище в кількості 0,00001% від маси середовища, впливаючи на личинок 2-3-денного віку. Таким чином, тривалість дії не перевищувала 2 діб. Мітохондрії виділяли з імаго 10 і 25 діб, тобто з мух молодого та зрілого віку. Що залишився після відділення мітохондріальних і ядерних фракцій сумарний препарат (цитозоль) містив мікросоми і розчинну частина клітин. Цитозоль використовували для визначення кількості вільних радикалів, що виробляються поза мітохондрій. Генерацію активних форм кисню в організмі самців і самок визначали окремо. Представлені раніше дані літератури підкреслюють важливу роль мітохондрій в процесі генерації вільних радикалів і зміні цього показника протягом життєвого циклу організму. Дійсно, отримані нами результати переконливо показують, що вміст активних форм кисню в мітохондріях як молодих, так і дорослих особин на порядок перевищує їх вміст у цитозолі.
Крім того, рівень освіти активних форм кисню в мітохондріях самців під всіх варіантах дослідів був у середньому в 2 рази вище, ніж у самок. Ці результати узгоджуються з нашими даними про те, що середня тривалість життя самців цієї лінії становить 22 дні, а самок - 30 днів. Вік самок до моменту вимірювання був менше середньої тривалості життя, а вік самців перевищив її. Ймовірно, у самців у досліджений період часу вже почалося вікове зниження активності системи антиоксидантного захисту, що відбилося на збільшенні рівня активних форм кисню, що продукуються мітохондріями. При дослідженні впливу пептидів на процес вироблення вільних радикалів в мітохондріях було показано, що достовірне зниження утворення активних форм кисню спостерігається тільки у самок при дії Вілона. При цьому рівень генерації активних форм кисню знижувався як у молодих (в 1,7 рази), так і у зрілих особин (в 1,5 рази) у порівнянні з контролем. Епіталон не чинив істотного впливу на процеси генерації активних радикалів. Ймовірно, дія Вілона, а також окремих пептидних фракцій, що входять до складу комплексного препарату Епіталамін, спрямоване на підтримку функціонального стану білків-переносників в дихального ланцюга, в той час як епіталон більшою мірою сприяє збільшенню активності ферментів антиоксидантного захисту клітини.



Відомо, що серце є органом, що характеризується високим рівнем енергообміну, сполученим з диханням. Клітини м'язових тканин серця містять велику кількість мітохондрій. Для встановлення можливої участі пептидів у регуляції функціональної активності дихального ланцюга мітохондрій визначали вплив, який чинять ВІЛОНА, тимоген і епіталон на експресію генів, представлених в серце. Пептидні препарати вводили у вигляді підшкірних ін'єкцій здоровим дорослим мишам лінії СБА. Тварини контрольної групи отримували підшкірні ін'єкції фізіологічного розчину. Відносні рівні експресії генів в серцях тварин контрольної та експериментальних груп вимірювалися методом гібридизації мічених радіоактивним ізотопом фосфору проб кДНК, приготованих із загальної РНК сердець з мікро-Арре у складі 15,247 клонів зі складу комплекту, що належить Національному інституту старіння США. Необхідно відзначити, що протестовані пептиди ВІЛОНА, тимоген і епіталон здатні впливати на експресію ядерних та мітохондріальних генів, представлених в серці здорових дорослих мишей. Під дією пептидів змінювалася експресія 1,25-1,74% всіх генів як у бік збільшення (до 6,61 рази в порівнянні з контролем), так і у бік зменшення (до 3,06 рази в порівнянні з контролем). Серед генів, експресія яких змінювалася при введенні в організм пептидів, відзначені групи, відповідальні за клітинну структуру і рухливість; гени, що кодують пептиди захисних систем клітини; група генів сприйняття клітинних сигнальних систем і систем комунікації. Особливу групу генів, що реагують на вплив досліджених пептидів, складають гени експресії регуляторних білків, гени регуляції метаболізму і клітинного поділу. У ході більш докладного розгляду змін, притаманних експресії мітохондріального геному під дією досліджених пептидів і мелатоніну, було виявлено, що пептиди змінюють більш ніж в 2 рази рівень таких мітохондріальних генів, як 16 S, НАДН-дегідрогенази 1, цитохром С оксидази 1, НАДН- дегідрогенази 4, НАДН-дегідрогенази 5, цитохром В.
До теперішнього моменту не встановлено, чи є безпосередня взаємодія досліджуваних пептидів з ядерної або мітохондріальної ДНК. Найімовірніше, пептиди епіфіза (синтетичні та природні), як і більшість пептидних гормонів та інших зовнішніх сигналів неліпофільной, природи реалізують своє регуляторний дію через універсальний для еукаріот мембранно-внутрішньоклітинний механізм. Такий механізм регуляції обміну речовин характерний для речовин, що не проникають через клітинну мембрану, і опосередкований дією вторинних медіаторів (месенджерів) - циклічних нуклеотидів цАМФ, цГМФ, іонів Са2 +, Церамид і фосфорілхоліном. Відомо, наприклад, що дія таких тканинних регуляторів поділу клітини, як кейлони та інтерферон, опосередковано дією цАМФ, в той час як дія фитогемагглютинин і факторів росту нервів - цГМФ і Са2 +. Встановлено, що в процесі передачі зовнішнього сигналу від пептидів Вілона, тимогена і епіталона до ядерної ДНК задіяні принаймні три клітинні системи вторинних месенджерів: аденилат-(гуанілат-) ціклазной (тимоген) і сфінгоміеліновая (ВІЛОНА, епіталон). У даній регуляторної системі пептиди (як нестероїдні гормони або будь-які інші позаклітинні регулятори) зв'язуються з рецепторами на поверхні клітини і активують аденилат (гуанілат)-циклазу або нейтральну сфінгоміелазу. Утворилися при цьому вторинні месенджери здійснюють свою дію через відповідні протеїнкінази (ферменти, що каталізують реакції фосфорилювання), а протеїнкінази на наступних етапах регулюють рівень фосфорилювання гістонів, негістонових білків хроматину (НГБ) або активують інші системи модифікації ядерних білків, у тому числі метилирование і ацетилювання гістонів .
Далі, в результаті фізико-хімічних змін, що виникають або в гістонових октамер, або в молекулі ДНК, відбувається ослаблення сили взаємодії між ДНК і гистонами і розгортання мінімальної нуклеосоми (структурної одиниці хроматину). ДНК, вільна від гістонів, стає доступною для зчитування інформації ферментами транскрипції. Відбувається білковий синтез. Таким чином регулюється матрична активність хроматину. По всій видимості, на перших етапах регуляції активності хроматину досліджувані нами пептиди продукують вироблення інших регуляторних ядерних білків і пептидів. Так, при дії Вілона і епіталона в клітинах серця спостерігали посилення експресії багатьох відомих регуляторних негістонових білків хроматину (убіквітину, убіквітіноподобного білка SUMO-1, Вох-білків, білків цинкового пальця ZNF01, HUMORFKG1B, Zfp61) і пов'язаних з їх функціонуванням систем (убіквітин- коньюгірующій фермент системи убіквітин-залежного протеолізу, протеїнази, пари циклин-циклінзалежної киназ).
Перераховані негістонові білки хроматину здійснюють контроль клітинного циклу і стимулюють синтез білків у відповідь на зовнішні впливи, в тому числі білків і ферментів, беруть участь у репарації ДНК. Відомо, що транскрипційно-активний хроматин містить підвищену кількість убіквітину, ковалентно зв'язаного з гістонів Н2А. Убіквітин відщеплюється від гістонів під час мітозу і коньюгірует знову при реплікації хроматину. Крім того, убіквітин забезпечує швидке розщеплення пов'язаних з ним білків на протеосомах (убіквітин-залежний протеоліз). Ця про-теолитическими система є частиною механізму регуляції клітинного циклу за допомогою активації убіквітин-залежного протеолізу багатьох факторів активації транскрипції, таких як цикліни і транскрипційні фактор Мус. Нещодавно виявлено, що є взаємозв'язок між убіквітин-залежним протеолізом і процесами мутагенезу і репарації ДНК. Зокрема, убіквітин-кон'югується ферментний комплекс бере участь у постреплікаціонной репарації ДНК і забезпечує захист ДНК від зовнішніх пошкоджень в різних денатуруючих умовах. На відміну від убіквітину група убіквітіноподобних білків, до яких відноситься SUMO-1, регулює перехід клітин з фази G2 у фазу мітозу допомогою контролю розміру теломеров та процесу сегрегації хромосом.
Добре відомо, що функціонування мітохондрій і репарація мітохондріальної ДНК неможливі без імпорту білків, кодованих ядерним геномом. Ферменти репарації ядерної ДНК синтезуються в цитоплазмі і за допомогою білків-переносників мітохондріальної мембрани транспортуються в матрикс мітохондрій. Ймовірно, так регулюється репаративна і Транскрипційних активність мітохондріальних генів під дією таких досліджених пептидів, як ВІЛОНА, тимоген і епіталон. Посилення загальної експресії мітохондріальних генів має дуже велике значення для старіючого організму, так як більшість мітохондріальних дисфункцій сполучені з заниженим рівнем транскрипції мітохондріальної ДНК, недостатнім білковим синтезом і ослабленим мітохондріальних диханням (продукцією енергії). Крім того, в основі більшості вікових мітохондріальних хвороб лежать мутації в одному або двох генах мітохондріальної ДНК, які кодують субодиниці дихального ланцюга.
У цьому випадку репарація дефектів генів і відновлення функцій мембранних білків зменшують ризик виникнення і розвитку мітохондріальних цітопатій. Досліджені пептиди ВІЛОНА, тимоген і епіталон посилюють експресію генів дихального ланцюга мітохондрій і особливо субодиниць ND4 і ND5 НАДН-дегідрогенази, що є перспективним для терапії нейродегенаратівних старечих захворювань, пов'язаних з мутаціями в цих генах, в тому числі гострої енцефалопатії, лейкодистрофії, міоклональной епілепсії, хвороби Паркінсона і хвороби Альцгеймера. Резюмуючи представлений огляд даних, слід підкреслити, що процеси вільнорадикального окислення відіграють істотну роль у механізмах старіння і розвитку вікової патології. Застосування пептидів для відновлення порушень пептідергіческой регуляції гомеостазу має важливе значення при лікуванні і профілактиці вікової патології.





UpDog logo  Proudly hosted with UpDog.